Методы биологических исследований

Общие методы биологических исследований

Общие методы делятся на две большие группы - теоретические и эмпирические. Теоретический и эмпирический методы практически никогда не используются по отдельности, ведь ни без того, ни без другого исследователю не удастся получить качественное и достоверное знание.

Эмпирические методы

Также эти методы называются практическими. Эмпирические методы предполагают получение знаний опытным путем, либо с использованием различных измерительных приборов (например, линейка, секундомер, циркуль и др.), либо основываясь на чувственном восприятии (с помощью органов чувств).

К эмпирическим методам относятся:

1. Наблюдение. Этот метод основывается на целенаправленном восприятием человеком различных биологических процессов и явлений. Пример: наблюдение за поведением диких животных, используя органы чувств

2. Описание. Данный метод основывается на методе наблюдения, в результате которого мы собираем и описываем различные факты и явления. К примеру, в результате наблюдения за дикими животными, мы составляем описание их поведения в различных ситуациях
3. Измерение. Данный метод предполагает использование различных измерительных приборов. Пример: измерение уровня насыщения кислородом крови человека при помощи пульсоксиметра, либо измерение частоты сердечных сокращений с использованием секундомера
4. Эксперимент. Суть этого метода исследования заключается в том, что мы получаем знания путем эксперимента, в ходе которого процессы и явления изучаются в строго контроллируемых нами условиях. Пример: лабораторный эксперимент, направленный на исследование скорости оседания эритроцитов пациента

Теоретические методы

Теоретические методы исследований предполагают умственную работу, в результате которой мы получаем умозаключение

К теоретическим методам относятся:

1. Сравнение. Совершая умственную работу, мы можем изучить сходства и различия между различными процессами, объектами или явлениями по какому-либо признаку. Пример: сравнение сходств и различий социального поведения разных видов пчёл
2. Классификация - это метод разделения крупной группы на более мелкие подгруппы по какому-либо признаку. Классификация подразумевает иерархию между своими элементами. После наблюдения, описания и сравнения различных процессов или явлений, ученый может классифицировать свои знания. Пример: создание классификации ядовитых растений по механизму их воздействия на организм человека
3. Анализ. Это метод теоретического исследования, в ходе которого человек разделяет целостный объект исследования на составные части, а затем изучает каждую по отдельности, в результате чего появляется возможность рассмотреть какое-либо явление, объект или процесс с разных его сторон
4. Синтез - это теоретический метод исследования, заключающийся в объединении ранее изученных по отдельности свойств объекта или явлений в единую систему, в результате чего мы получаем возможность изучить эти самые объекты и явления как единое целое, принимая во внимание взаимосвязь ранее разделенных его частей
5. Обобщение. Также называется индукцией. Используется для установления общих свойств и признаков изучаемых объектов путем перехода от частного к более общему понятию или суждению. Обобщение является крайне важным теоретическим методом при построении фундаментальных теорий. Пример: изучив окраску нескольких представителей пчел одного вида, мы можем предположить, что данный окрас свойственен всем пчелам данного вида.
6. Исторический метод предполагает изучение истории чего-либо для того, чтобы установить на этой основе общую закономерность процесса или явления. Используется, например, при изучении закономерностей появления какого либо анатомического образования или физиологического процесса, а также для изучения становления структуры и функций организмов
7. Абстрагирование позволяет не учитывать какие-либо свойства объекта или явления, одновременно с выделением интересующих исследователя других свойств и особенностей этого объекта или явления
8. Моделирование. Суть моделирования заключется в создании математических, компьютерных и др. моделей для изучения свойств интересующего нас объекта или явления. В биологии чаще используются биологические и физико-химические модели. Пример: врач-эпидемиолог создает компьютерную модель распространения нового вируса среди населения для изучения скорости и широты распространения новой болезни

Радиоуглеродное датирование

Метод радиоуглеродного датирования активно применяется в палеонтологии для определения возраста останков ископаемых организмов. Все живые организмы содержат в себе как радиоактивный, так и нерадиоактиный углерод, который организм поглощает с пищей в течение жизни. После смерти организма поглощение углерода с пищей прекращается. С течением времени радиоактивный углерод распадается, однако, по его остаточной активности можно определить, как давно погиб организм.

Методы изучения ДНК

Для изучения молекул ДНК используются молекулярно-генетические методы.

Существуют следующие методы изучения ДНК:

1. ДНК-зонд
2. ПЦР
3. Генетическая дактилоскопия
4. Секвенирование
5. Молекулярное клонирование

ДНК-зонд

В основе исследования молекулы ДНК при помощи ДНК-зонда лежит использование меченого фрагмента ДНК, который гибридизируется (грубо говоря, соединяется) с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью. Для того, чтобы пометить фрагмент ДНК используются радиоактивные изотопы и хромофоры. ДНК-зонды могут применяться в том числе для выявления интересующей исследователя последовательности нуклеотидов в образце.

ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) лежит в основе лабораторного метода, позволяющего определить присутствие интересующей исследователя последовательности нуклеотидов, а также амплифицировать и измерять количество копий этой последовательности. Метод ПЦР позволяет многократно продублировать интересующий исследователя фрагмент ДНК при помощи специальных ферментов. В результате многократного дублирования (амплификации) образуется количество ДНК, достаточное для визуального обнаружения. Амплификация - процесс накопления копий необходимой нуклеотидной последовательности в ходе ПЦР. Для успешного и контроллируемого лабораторного процесса амплификации используются специальные приборы - амплификаторы.

Помимо амплификации, метод ПЦР позволяет производить другие манипуляции с ДНК, такие как введение мутаций или сращивание фрагментов ДНК друг с другом. ПЦР используется и в биологических исследованиях, и в медицине. С его помощью определяют наличие заболеваний, устанавливают родственные связи, а также выделяют новые гены или клонируют старые при проведении генетических исследований.

Генетическая дактилоскопия

Генетическая дактилоскопия позволяет точно идентифицировать организм на основе уникальных и неизменных с течением жизни последовательностей нуклеотидов в ДНК. Применяется при судебно-медицинских экспертизах, для установления родства организмов, а также для широкого круга других задач, связанных с идентификацией организма.

Секвенирование

Секвенирование - это определение нуклеотидной или аминокислотной последовательности. Размеры исследуемого участка ДНК зависят от применяемого метода секвенирования.

Секвенирование по Сэнгеру

Секвенирование по методу Сэнгера (метод обрыва цепи) было предложено Фредериком Сэнгером в 1977 году. Этот метод основан на ферментативном копировании изучаемой молекулы ДНК, а также на включении в растущую цепь ДНК терминирующих аналогов нормальных нуклеотидов. Давайте выясним, как работает метод Сэнгера.

Представим, что в растворе присутствует:

1. Матричная цепь ДНК, нуклеотидную последовательность которой мы хотим выяснить
2. Праймер - короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, являющийся затравкой для начала синтеза ДНК. ДНК-полимераза включает в растущую цепь новые нуклеотиды, а праймер нужен им для инициации этого процесса.
3. Секвеназа - модифицированный аналог ДНК-полимеразы также находится в растворе
4. Нуклеотиды, которые будут включаться во вновь синтезируемую цепочку ДНК
5. Особые нуклеотиды - терминирующие (останавливающие) синтез ДНК дидезоксирибонуклеотиды, являющиеся аналогами обычных нуклеотидов. От нормальных нуклеотидов, из которых построена цепь ДНК, их отличает строение. Эти нуклеотиды флуоресцентны, но что самое важное, в этих особых нуклеотидах отсутствует одна из химических групп (3’-OH группа), отвечающая за включение следующего нуклеотида в цепь. После того, как секвеназа включит один из этих терминирующих синтез ДНК модифицированных нуклеотидов в цепочку, произойдет остановка сборки цепи. Дальше синтез цепочки нуклеотидов не пойдет, потому что секвеназа не сможет включить в синтезируемую цепочку следующий нуклеотид.

Соотношение обычных нуклеотидов и их терминирующих аналогов подбирается таким образом, чтобы в растворе во время секвенирования синтезировалось множество фрагментов одной и той же последовательности разной длины.

В итоге, в растворе теперь присутствует множество разных фрагментов ДНК разной длины. Одни из них длиннее, а другие короче, но их объединяет то, что на конце у них всех находится флуоресцентный терминирующий аналог нуклеотида, который теперь можно обнаружить и понять по его свечению, аденин это, тимин, гуанин или цитозин.

Для того, чтобы разделить фрагменты ДНК разной длины используется электрофорез в полиакриламидном геле. На одном конце образца помещают отрицитальный заряд, а на другом - положительный. Фрагменты ДНК заряжены отрицательно, соответственно, во время электрофореза, находясь в дорожке полиакриладного геля, они будут двигаться к положительному электроду. Быстрее к положительному заряду будут двигаться короткие и более мелкие фрагменты днк. Чем тяжелее фрагменту ДНК проходить через полиакриладный гель, тем медленнее он будет в нем двигаться.

Затем, после разделения электрофорезом разных цепочек, меченые терминирующие нуклеотиды обнаруживаются в специальном приборе. После этого формируется файл, в том или ином виде содержащий информацию о строении цепи ДНК, нуклеотидную последовательность которой исследователю было необходимо выяснить.

Молекулярное клонирование

Молекулярное клонирование ДНК основано на использовании других живых организмов (чаще всего бактерий и бактериофагов). Для клонирования ДНК этим методом необходимо внести клонируемую молекулу ДНК в бактериальную плазмиду или геном бактериофага. Размножаясь, организм многократно и точно копирует необходимую ДНК. Для того, чтобы впоследствии отделить организмы с целевой ДНК от организмов без нее, применяются антибиотики, ведь помимо необходимой для клонирования ДНК, вместе с ней в бактерию вводился ген резистентности к антибиотикам. Таким образом, в организме, который многократно клонирует ДНК, помимо самой последовательности нуклеотидов присутствует и ген резистентности к антибиотикам, в результате чего антибиотик не оказывает на бактерии никакого губительного воздействия. С другой стороны, организмы без такого гена, не участвовавшие в клонировании, погибают, позволяя исследователю выделить из выживших организмов нужную ДНК.

Методы цитологии

Методы цитологических исследований применяются для изучения строения, физиологии и структур клеток.

Существуют следующие методы цитологии:

1. Микроскопия
2. Центрифугирование
3. Метод культуры клеток и тканей
4. Хроматография
5. Метод меченых атомов

Микроскопия

Микроскопия - это изучение объектов при помощи светового или электронного микроскопа. Во время световой микроскопии можно увидеть основные структуры клетки, такие как ядро и клеточная стенка. Также можно увидеть расположение тканей на срезах. При электронной микроскопии можно различить мельчайшие структуры и органеллы клетки, к примеру, рибосомы.

Микроскопия обширно применяется в медицине для диагностики заболеваний и для исследования различных тканей и органов человека. Например, методом микроскопии можно определить количество лейкоцитов в крови.

Центрифугирование

Метод центрифугирования основывается на возникновении центробежных сил, возникающих во время работы центрифуги. Центрифугирование позволяет разделить неоднородные субстанции на фракции.

В биологии центрифугирование используется для фракционирования клеточных структур. Этот метод позволяет выделить отдельные клеточные структуры и органеллы, которые во время центрифугирования формируют разные фракции: самые тяжелые и плотные элементы клетки оседают внизу, а самые легкие - наверху. Фракционирование клеточных структур начинается с гомогенизации, позволяющей исследователю предварительно освободить органеллы и биомолекулы из клеток.

Порядок оседания органоидов: ядро (самое тяжелое и плотное), митохондрии (хлоропласты), лизосомы, рибосомы, субъединицы рибосом.

Метод культуры клеток и тканей

В основе метода культуры клеток и тканей лежит выращивание клеток на питательной среде в стерильных условиях.

Хроматография

Метод хроматографии применяется для разделения и анализа белков и пигментов. Рассматривая, например, растение, исследователю сложно сказать, какие пигменты в нём содержатся. Хроматография решает эту проблему, ведь в результате применения хроматографического метода мы получаем хроматограмму, на которой пигменты разделены в зависимости от их скорости движения в растворителе.

Метод меченых атомов

Во время исследования методом меченых атомов ученые заменяют обычные атомы на их изотопы. Для этого могут использоваться как радиоактивные, так и нерадиоактивные изотопы. В результате этого, регистрируя поведение меченых атомов, исследователь может изучать какие-либо явления в живых клетках, например скорость прохождения вещества через клеточную мембрану или процесс синтеза белков.

В медицине метод меченых атомов применяется при исследовании щитовидной железы. Пациент принимает внутрь радиоактивный изотоп йода, который накапливается в щитовидной железе, после чего меченые атомы регистрируются с помощью специальных приборов, например, гамма-камеры. Несмотря на то, что изотоп йода отличается от обычного йода по физическим свойствам, он может участвовать во всех обменных процессах так же, как и стабильный йод. По полученным данным можно выявить, как щитовидная железа поглощает йод, и как он перемещается внутри неё.

В биологии метод меченых атомов активно применяется для исследования процессов фотосинтеза

Методы генетики

Методы генетических исследований применяются учеными для изучения генов, наследственности и генетических вариаций в организмах.

Существуют такие методы генетики:

1. Гибридологический метод
2. Мутационный метод
3. Генеалогический метод
4. Близнецовый метод
5. Цитогенетический метод
6. Кариотипирование
7. Популяционно-статистический метод
8. Биохимический метод

Гибридологический метод генетики

Не применяется при исследовании человека. Гибридологический метод генетических исследований основывается на скрещивание организмов с последующим изучением и анализом их потомства. Данный метод позволяет изучать наследственные свойства организмов. Гибридологический метод основан на рекомбинации, ведь известно, что благодаря перераспределению генов в момент формирования гамет возникают новые сочетания генов. Данный метод предложил и впервые применил ученый биолог Грегор Мендель.

Мутационный метод

Не применяется при исследовании человека. При использовании мутационного метода генетических исследований у интересующего организма намеренно вызывают мутации, после чего изучают его генетические особенности.

Генеалогический метод

Основой генеалогического метода генетики является составление генеалогического древа - схемы, в которой указаны родственные связи поколений. Этот метод помогает исследователям установить особенности наследования признаков организмов. Также данный метод позволяет выявлять мутации определенных генов даже без их непосредственного изучения. Генеалогический метод широко применяется при исследовании генетики человека, так как в отличие от мутационного и гибридологического метода, его использование не влечет за собой нарушения правил этики.

Близнецовый метод

Близнецовый метод генетики основан на исследовании монозиготных (однояйцевых) близнецов, являющихся генотипическими и фенотипическими копиями друг друга. Монозиготные близнецы появляются на свет в результате развития из одной яйцеклетки двух и более плодов. Благодаря близнецовому методу можно оценить, насколько на идентичные генотипически организмы влияют факторы внешней среды, определить степень генетической предрасположенности к различным заболеваниям, а также узнать влияние внешних факторов на формирование качеств человека.

Цитогенетический метод

Сутью цитогенетического метода генетики является исследование кариотипа (совокупность полного набора хромосом и их признаков). Цитогенетические исследования проводятся при помощи микроскопа и позволяют оценить возможные хромосомные нарушения, предсказать возможные болезни будущих детей, а также помочь при выяснении причины бесплодия.

Кариотипирование

После цитогенетического исследования кариотипа создается упорядоченная карта выстроенных в ряды хромосом исследуемого организма. Кариотипирование позволяет определить наличие хромосомных перестроек, а также пол человека на стадии эмбриона.

Популяционно-статистический метод

Когда исследователям необходимо оценить, насколько часто в популяции встречается тот или иной ген, применяется популяционно-статистический метод генетических исследований. Данный метод может помочь в предсказании вероятности возникновения генетических аномалий у особей, ведь при использовании популяционно-статистического метода составляются карты распространения генов, по которым можно отследить гены, обуславливающие развитие нормальных признаков, и гены, вызывающие наследственные болезни.

В исследованиях генетики человека популяционно-статистическим методом особый интерес для ученых представляют группы людей, отделенные от основной массы населения какими-либо факторами, например, географическими или религиозными. Этот интерес вызван тем, что в таких группах (называющихся изолятами) браки заключаются с другими членами группы. При условии изоляции группы от остального мира (особенно, если группа еще и очень маленькая), возникают браки между кровными родственниками. Со временем в популяции с большой вероятностью многие рецессивные гены проявятся, перейдя в гомозиготное состояние, последствия чего изучаются учеными-генетиками с повышенным интересом.

Биохимический метод

Биохимический метод применяется в случае, когда исследователю нужно выявить наличие в жидкостях организма белковых продуктов, структура которых закодирована в определенных (возможно поврежденных) генах, или аномальных метаболитов клеток.

В медицине биохимический метод применяется при диагностике сахарного диабета. У человека берут кровь на анализ, после чего оценивается количество С-пептида (C-Peptide или Connecting Peptide) в сыворотке крови. Измерение количества С-пептида помогает определить количество инсулина, вырабатываемого поджелудочной железой, поскольку С-пептид секретируется в эквимолярных (идентичных) количествах по отношению к инсулину. При диагностике сахарного диабета результату анализа количества инсулина в крови придается меньшее значение в сравнении с количеством С-пептида, так как на измерение С-пептида не оказывают влияние внешние факторы, такие как прием инъекций инсулина или прием пищи. Кроме того, в отличие от С-пептида, инсулин быстро метаболизируется, поэтому его количество в крови может стремительно меняться. Таким образом, измерение количества С-пептида позволяет наиболее точно определить количество инсулина, вырабатываемого поджелудочной железой человека.

Методы селекции

Селекция направлена на улучшение существующих сортов растений и животных, а также на создание новых полезных человеку видов.

Основные методы селекции:

1. Метод полиплоидизации
2. Гибридологический метод селекции
3. Метод искусственного мутагенеза
4. Метод ментора (метод Мичурина)
5. Испытание производителя по потомству

Метод полиплоидизации

Метод полиплоидизации основан на геномной мутации - полиплоидии, суть которой заключается в кратном увеличении числа хромосом в ядре.

Причины полиплоидии:

1. Нерасхождение хромосом в анафазе митоза. В результате нерасхождения хромосом их количество удваивается. Это явление можно вызвать искусственно, применяя митозные яды (колхицин, винбластин, аценафтен), разрушающие веретено деления во время расхождения хромосом. Кроме того, полиплоидные клетки можно получить в результате использования:

• рентгеновского излучения
• повышенных или пониженных температур
• химических веществ, таких как хлороформ или эфир

2. Эндомитоз, заключающийся в удвоении числа хромосом в ядре без последующего деления самой клетки и ее содержимого
3. Спонтанное возникновение полиплоидии без видимых на то причин

Полиплоидизация применяется в селекции для получения высокоурожайных сортов растений. Ещё одним применением метода полиплоидизации является преодоление межвидовой стерильности. В селекции используется метод отдаленной гибридизации, заключающийся в скрещивании растений разных видов или даже родов. Однако, скрещивание растений разных систематических групп приводит к стерильности (невозможности размножаться) у их потомков. Для решения вопроса стерильности гибридов первого и последующих поколений применяется метод полиплоидизации, способный восстановить плодовитость полученных растений.

Гибридологический метод селекции

В основе этого метода лежит гибридизация - получение гибридов, образующихся после скрещивания организмов.

Внутривидовая гибридизация происходит в пределах одного вида.

Отдалённая (межвидовая) гибридизация происходит между организмами разных систематических групп. Полученные таким образом гибриды чаще всего не способны размножаться дальше (они стерильны).

Инбридинг - это близкородственное скрещивание организмов, находящихся в одной популяции. Инбридинг используют для закрепления полезных человеку признаков в генотипе: гибриды, полученные в результате инбридинга, обладают высокой гомозиготностью. Однако, инбридинг приводит к снижению жизнеспособности организмов (это называется инбредной депрессией). Рецессивные гены, отвечающие за развитие генетических патологий, у гибридов также переходят в гомозиготное состояние и проявляются у потомства.

Аутбридинг - неродственное скрещивание организмов. В результате аутбридинга происходит гетерозис - повышение жизнеспособности гибридов. Увеличение жизнеспособности связано с переходом генов в гетерозиготное состояние, в результате чего рецессивные гены, которые могут вызывать генетические болезни, не проявляются.

Метод искусственного мутагенеза

Суть искусственного мутагенеза заключается в воздействии на организм мутагенными факторами, в результате применения которых у организма развиваются мутации. Во время искусственного мутагенеза организмы могут облучать рентгеновскими или ультрафиолетовыми лучами. Целью искусственного мутагенеза является увеличение генетического разнообразия и получение полезных мутаций, которые можно в дальнейшем использовать для получения новых штаммов микроорганизмов или новых сортов растений. Применение колхицина позволяет вызвать полиплоидию (геномную мутацию).

Метод ментора

Метод селекции растений, который иногда называется методом Мичурина. Основой данного метода является прививание растений одного сорта на растения другого сорта. При этом растение-ментор воздействует на растение другого сорта, привитое и развивающееся на нем.

Данный метод позволяет избавляться от нежелательных качеств растения и закреплять полезные для селекционера свойства. К примеру, при использовании метода Мичурина на яблонях, удалось добиться улучшения качества плодов и повышения морозостойкости.

Испытание производителя по потомству

Это метод селекции животных, который позволяет определить качество и наследственные признаки родительского организма по его потомкам. Он позволяет выбрать лучшего производителя, потомство которого обладает необходимыми признаками и свойствами. Метод испытания производителя по потомству применяется при селекции домашних животных. Например, невозможно определить, какие гены, отвечающие за количество производимого молока несет в себе самец коровы. Для этого изучается его потомство, после анализа которого и оценивается качество генов, которые несет в себе бык-производитель.

Методы биотехнологии

Предметом биотехнологии является использование технических и естественных наук совместно с биологическими системами и процессами в сельском хозяйстве и промышленности, позволяющее использовать возможности живых организмов для создания или модификации продуктов или процессов различного назначения.

Рассмотрим следующие методы биотехнологии:

1. Генная инженерия
2. Клеточная инженерия

Генная инженерия

Метод генной инженерии основан на работе с генетической информацией. Вмешиваясь в генетический аппарат клетки, ученые могут получать модифицированные (рекомбинантные) ДНК и РНК, осуществлять манипуляции с отдельными генами и внедрять их в другие организмы. Также во время использования метода генной инженерии может осуществляться работа с генетическим аппаратом бактериофагов или бактерий (работа с плазмидами бактерий).

У генной инженерии множество применений:

1. Одним из важнейших достижений генной инженерии является технология, позволяющая получать человеческий инсулин благодаря использованию генномодифицированных бактерий
2. Генная инженерия позволяет получать новые сорта зерновых культур. Биотехнологи помещают в культурное растение ген, позволяющий ему сопротивляться дейстивю ядов (гербицидов), применяемых на зерновых полях для борьбы с сорняками. Благодаря этому полезные растения выживают, а растения-вредители погибают
3. Генная инженерия позволяет получать растения, которые могут выживать на поле без обработки инсектицидами, благодаря встроенным в них генам, защищающим их от насекомых-вредителей

4. Некоторые генномодифицированные растения могут расти на неподходящем субстрате, например, на сильно засоленной почве. Это становится возможным благодаря переносу гена устойчивости из растений, для которых засоленная почва является привычным местом произрастания

Клеточная инженерия

Клеточная инженерия занимается гибридизацией клеток, их клонированием, пересадкой ядер или целых хромосом из одних клеток в другие, а также работой с каллусной тканью (состоящей из клеток, потерявших специализацию). Кроме того, клеточная инженерия направлена на создание клеток, способных производить нужные вещества вне организма.